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新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿死亡和致残的主要原因之一，对白质和灰质造成实质性损伤，可导致严重的神经行为功能障碍，包括智力残疾和运动障碍。炎症、神经细胞死亡和脑白质损伤是HIE病理过程中的重要因素。6-姜辣素是一种生姜提取物，可以减少炎症反应和细胞死亡。然而，6-姜辣素在新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBI)中的作用尚不清楚。本研究建立了小鼠脑缺血再灌注损伤模型，采用行为学、组织学染色、定量聚合酶链式反应和免疫印迹等方法分析了6-姜黄素对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
1. 6-姜黄素可减少脑损伤，改善短期神经功能
为探讨6-姜辣素对HIBI的缓解作用，在HIBI后给予6-姜辣素1 mg/kg、2 mg/kg和4 mg/kg，每日1次，连续4d。TTC染色定量各组脑梗塞体积，正常脑组织染色为红色，缺血区为白色。如图1A、B、MICE所示，假手术组无明显脑缺血区，而HIBI组大鼠脑缺血面积明显增加。然后，我们通过检测脑含水量来进一步评估脑水肿，发现6-姜黄素治疗后HIBI组小鼠脑含水量在HIBI后3天下降(图1C)。
展开剩余85%假手术组神经细胞染色清晰，细胞形态规则。然而，HIBI后神经细胞的排列变得松散和无序，6-姜辣素治疗后这种情况得到缓解(图1D)。在后肢悬吊实验中，HIBI组的悬吊持续时间略短，而6-姜辣素治疗组的悬吊时间明显长于HIBI组(图1F)。如图1G所示，HIBI组完成翻正反射的时间更长。相反，在HIBI组，6-姜辣素治疗显著减少了翻正反射时间。
图1 6-姜酚对脑梗塞面积和神经反射的影响。
2. 6-姜黄素减轻HIBI诱导的细胞凋亡
随后，作者团队在HIBI 3天后进行尼氏染色和TUNEL染色，观察6-姜辣素对HIBI后细胞凋亡的影响。如图2A所示尼氏小体较大，分布密集。HIBI导致同侧脑组织丢失。其余神经元排列紊乱，核固缩，尼氏小体消失。但与HIBI组相比，HIBI+6G组神经元坏死程度减轻，神经元和尼氏小体增多。在图2B，C中，HIBI组比Sham组有更多的TUNEL阳性细胞。经6-姜黄素处理后，凋亡细胞数明显减少。
为进一步证实6-姜辣素对HIBI的抗凋亡作用，采用免疫印迹法检测Bcl2、Bax和裂解PARP I在脑内的表达水平(P10)。如图2D-F所示，与Sham组相比，HIBI组Bcl2/Bax比值降低，裂解PARP I表达水平升高。这些结果提示6-姜辣素具有重要的抗细胞凋亡作用。
图2 6-姜黄素减轻HIBI诱导的神经细胞凋亡。
3. 6-姜黄素抑制促炎基因表达和小胶质细胞活化
为探讨6-姜辣素对炎症反应的调节作用，我们在HIBI后3天检测了促炎症细胞因子的mRNA表达(P10)。如图3A所示，HIBI组IL-1β和肿瘤坏死因子-α的表达水平显著上调，而6-姜辣素治疗降低了HIBI后IL-1β和TNF-α的表达水平。同时，6-姜辣素治疗后HIBI后IL-1β和TNF-α的蛋白水平也明显下降(图3B，C），已有报道表明小胶质细胞在神经炎症中起主要作用。
结果发现，与假手术组比较，6-姜黄素组双阳性细胞数明显减少(图3D，E)。因此，这些结果表明6-姜辣素可以减轻HIBI诱导的炎症反应。
图4 6-姜辣素改善HIBI诱导的脑萎缩和长期神经功能障碍。
5. 6-姜黄素抑制缺氧诱导的髓鞘丢失
髓鞘发育与运动功能密切相关，作者团队分别于HIBI后4周进行LFB和MBP染色，以观察骨痂髓鞘损伤情况(P35)。如图5A所示，从HIBI组收集的切片显示相当程度的脱髓鞘，如LFB染色的髓鞘丢失所示。6-姜黄素处理组LFB染色髓鞘密度明显增加。在图5B中，HIBI小鼠的MBP染色的免疫荧光强度较低，而6-姜黄素治疗可以阻止HIBI后同侧膝盖骨MBP染色髓鞘的减少。同样，免疫印迹分析MBP的蛋白水平结果表明，HIBI后同侧胼胝体中MBP的表达降低。6-姜辣素治疗可显著改善HIBI所致的血压下降。综上所述，我们的数据表明，6-姜酚可以防止HIBI后髓鞘的丢失。
图5 6-姜黄素抑制缺氧缺血后4周缺氧诱导的髓鞘丢失。
6. 6-姜黄素促进少突胶质细胞成熟和减轻少突胶质细胞凋亡
大量研究表明，HIBI会导致一种称为脑室周围白质软化的白质损伤，这是脑部和长期神经疾病的主要原因。为探讨6-姜辣素对少突胶质细胞的影响，在HIBI后3天(P10)进行少突胶质细胞标记物(OLL2)和少突胶质细胞前体细胞标记物(PDGFR-α)的免疫组织化学染色。如图6A，B所示，与HIBI组相比，HIBI组显著增加了PDGFR-α+Olg2+细胞的数量，而6-姜辣素处理组减少了双阳性细胞的数量。此外，用Olig2 和APC(一个成熟少突胶质细胞的标志)双重染色来评价HIBI后少突胶质细胞的成熟情况。图6C、D显示HIBI减少了APC阳性(APC+)/Olig2+细胞的数量。如图6E，F所示，与HIBI组相比，HIBI组显著增加了双阳性细胞的数量，而6-姜辣素处理组减少了少突胶质细胞的细胞死亡。
图6 6-姜酚促进少突胶质细胞成熟，减少少突胶质细胞凋亡。
7. 6-姜酚通过调节AKT、ERK和NF-κB通路及表观遗传修饰发挥神经保护作用
神经炎症在缺氧缺血性脑损伤中起重要作用。因此，我们在HIBI后3天检测到炎症相关途径蛋白在大脑中的表达(图7A-D)。结果表明，与假手术组相比，6-姜黄素能显著下调p-AKT的表达，而6-姜黄素则能激活p-AKT通路，提高p-AKT的表达。此外，HIBI后ERK通路被激活，6-姜酚可以逆转这种变化。此外，HIBI后磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)水平升高。综上所述，这些结果表明6-姜酚可能通过调节表观遗传修饰而发挥神经保护作用。
图7 与AKT、ERK和NF-κB通路相关的蛋白质水平，以及组蛋白乙酰化和甲基化。
结论
胎儿或新生儿期缺氧缺血性脑损伤是导致新生儿死亡和新生儿神经功能障碍的主要因素。目前，HIE多采用亚低温治疗，但效果并不理想。许多患病的儿童会出现永久性的神经系统后遗症，如运动障碍、智力残疾等。因此，迫切需要探索新的治疗方法。近年来的研究表明，6-姜辣素作为一种治疗神经系统疾病的新型中药，具有显著的抗炎、抗细胞凋亡和抗氧化应激作用。
在该研究中，研究人员使用了赛昂斯转棒疲劳仪（Sansbio，SA102）来进行实验操作。
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